Приложение к Распоряжению от 16.05.2011 г №№ 257-Р, 44 Извещение
Специфическая лабораторная диагностика крымской геморрагической лихорадки
Отбор проб
и транспортировка биологического материала от людей (трупов)
Лабораторная диагностика Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) проводится молекулярно-биологическими, серологическими и вирусологическими методами.
Вирус КГЛ и его антиген обнаруживаются в крови больного до 7 - 10-го, иногда до 14-го дня болезни. Специфические антитела иммуноглобулины класса М к вирусу КГЛ начинают выявляться у больного с 7 - 10-го дня болезни.
Соответственно забор материала для лабораторного подтверждения Крымской геморрагической лихорадки производится:
- для обнаружения методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) рибонуклеиновой кислоты (РНК) вируса КГЛ и антигена вируса КГЛ до 10-го дня болезни. Материал доставляется в лабораторию обеспечения эпидемиологического надзора за особо опасными инфекциями ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Астраханской области" (Астрахань, ул. Н. Островского, 138);
для определения уровня антител и нарастания уровня антител:
первый забор - при подозрении на КГЛ;
второй забор - на 10-е сутки болезни;
третий забор - на 17 - 20-й день болезни (при необходимости).
Организация отбора проб и транспортировка биологического материала от людей (трупов) для лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) осуществляется в соответствии с требованиями Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)" и Санитарных правил СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности" (утв. Постановлением Госкомсанэпиднадзора РФ от 28 августа 1995 г. N 14).
Отбор проб от больных и подозрительных на заражение вирусом КГЛ осуществляет медицинский персонал с соблюдением правил противоэпидемического режима. Необходимо использование защитного костюма, перчаток, маски и очков (щитков).
Каждую пробирку маркируют и оформляют направление с указанием фамилии, имени, отчества больного, возраста, даты начала заболевания, вида материала и времени и даты его забора и помещают вместе с направлением в первичную герметичную емкость для транспортировки.
Материалом для исследования служит:
- кровь;
- секционный материал: печень, легкие, селезенка, почки, мозг (головной и спинной).
Забор материала
Забор крови на обнаружение РНК вируса КГЛ методом ПЦР производится натощак из локтевой вены в объеме 4.5 мл одноразовой иглой (диаметр 0.8 - 1.1 мм) в одноразовый шприц или специальную вакуумную систему типа "Venoject" (с ЭДТА), "Vacuettr" (сиреневые крышки - 6% ЭДТА).
Взятую в шприц кровь аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую пластиковую пробирку с антикоагулянтом. В качестве антикоагулянта используется 3.8% раствор цитрата Na или 6% раствор ЭДТА. Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! Соотношение крови и антикоагулянта составляет при использовании 6% раствора ЭДТА 1:20 и при 3.8% раствора цитрата Na - 1:9, т.е. на 4.5 мл крови используется 0.5 мл антикоагулянта.
Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают несколько раз (8 - 10 раз) для перемешивания с антикоагулянтом.
Образцы цельной крови до транспортировки в лабораторию могут храниться при температуре 2 - 80°С в течение 6 часов с момента взятия материала. Недопустимо замораживание образцов цельной крови!
Образцы (кровь, биоптаты и др.) должны быть доставлены в лабораторию для проведения ПЦР в день взятия материала.
Забор крови для серологической диагностики отбирают из локтевой вены в стерильную пробирку в количестве 5 - 10 мл, соблюдая правила асептики. Для предотвращения гемолиза сыворотку следует отделить от сгустка. Для этого пробирку с кровью оставляют при комнатной температуре в наклонном положении до образования сгустка, сгусток крови обводят стеклянной палочкой и помешают в холодильник при температуре +4°С на 10 часов. Полученную сыворотку отсасывают пипеткой с резиновой грушей в пластиковую одноразовую пробирку, герметично закрывают и направляют в лабораторию для исследования на наличие специфических антител.
Допустимо сыворотку крови хранить в стерильных пробирках при температуре +4°С в течение 5 дней.
Вскрытие умерших от КГЛ, а также подозрительных на данную инфекцию производится при наличии анамнестических и клинических признаков КГЛ без подтверждения диагноза лабораторными исследованиями с применением средств индивидуальной защиты (противочумный костюм I типа) и мер личной безопасности в соответствии с требованиями методических указаний "Организация и проведение первичных мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевание карантинными инфекциями, контагиозными вирусными геморрагическими лихорадками, малярией и инфекционными болезнями неясной этиологии, имеющими международное значение. МУ 3.4.1028-01" под наблюдением специалиста противочумного учреждения или специалиста по особо опасным инфекциям Управления Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации. При этом требованиям биологической безопасности отвечает метод вскрытия in situ (на месте) без извлечения органов из полостей трупа. В этом случае инфицированная кровь, содержимое органов и полостей стекают в грудную и брюшную полости трупа, уменьшая возможность загрязнения окружающих предметов и персонала.
Перевозка трупа и его захоронение осуществляются в соответствии с требованиями вышеуказанных методических указаний в присутствии специалиста противочумного учреждения или специалиста по особо опасным инфекциям управления Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации.
Отбор секционного материала производится из глубины внутренних органов (сердце, печень, легкие, селезенка, почки, головной мозг), стерильно вырезают кусочки ткани размерами 2 - 3 см. Стерильной пастеровской пипеткой с резиновой грушей забирают 8 - 10 мл крови из сердца. Следует отбирать материал из нескольких участков, подвергшихся изменениям, и из участка рядом расположенной ткани, которая выглядит неизмененной. При наличии распада ткани основное внимание обращают на пограничную зону. Отбор секционного материала необходимо производить как можно быстрее после смерти больного (не более 20 часов нахождения при комнатной температуре).
Для проведения исследования на обнаружение в секционном материале РНК вируса КГЛ методом ПЦР готовят микробиоптат (пунктат)/микроаутоптат, который помещают в микропробирки с закручивающимися крышками или пробирки объемом 1.5 мл с защелкой и опускают в емкость для транспортировки.
Транспортировка материала
Перед транспортировкой в лаборатории материал, помещенный в первичную герметично закрывающуюся тару, помещают во вторичную тару, представляющую собой металлический или пластиковый пенал.
Транспортировка материала осуществляется обязательно в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом.
Запрещается:
1.Использовать гепарин в качестве антикоагулянта.
2.Проводить забор крови для ПЦР в многоразовые стеклянные пробирки.
3.Замораживать образцы цельной крови.
4.Центрифугировать.
5.Производить встряхивание пробирок с кровью, сывороткой.
6.Пипетировать ртом.
7.Использовать стеклянные пробирки с ватно-марлевой пробкой для транспортировки материала.
Пробы с клиническим материалом с целью подтверждения диагноза КГЛ методом ПЦР передаются в лабораторию обеспечения эпидемиологического надзора за особо опасными инфекциями ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Астраханской области" (Астрахань, ул. Н. Островского, 138).
Доставка проб материала на исследование в лабораторию производится:
- понедельник - пятница с 8.30 до 16.00.
Пробы с клиническим материалом с целью подтверждения диагноза КГЛ серологическим методом передаются в вирусологическую лабораторию ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Астраханской области" в рабочие дни с 9.00 до 16.00.